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タイトル: Toll-like receptor 9によるリガンド認識機構の解析
その他のタイトル: The analysis of the mechanisms underlying CpG recognition by Toll-like receptor 9
著者: 松本, 文
著者(別言語): マツモト, フミ
発行日: 2009年3月23日
抄録: Toll-like receptor 9 (TLR9)は細胞内に取り込まれた病原微生物が含有するDNAのCpGモチーフを認識し、細胞活性シグナルを伝達している。TLR9をはじめとする細胞内TLRは、細胞表面に発現しているTLR4などと比較するとまだ分かっていないところが多い。本研究において核酸認識TLRのリガンド認識について理解を深めるためにTLR9を中心として検討した。//第一章では、TLR9のco-receptor分子を同定するためにcDNAライブラリを用いてFunctional Cloningを実施した。CpG-ODN(Oligodeoxynucleotides)に対してNF-κB活性反応を示さないマウスプロB細胞株Ba/F3細胞にCpG刺激に対してNF-κB 活性反応を示すマウス脾臓細胞あるいはマウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞由来のcDNAライブラリを導入することによって、CpG刺激に対して活性化可能となったBa/F3細胞を選択、獲得した。このポジティブ細胞が含有する責任遺伝子をクローニングし、TLR9のCpG認識に重要な分子としてシステインプロテアーゼであるカテプシンBとカテプシンLを同定した。野生型のカテプシンを遺伝子導入したBa/F3細胞においてはCpG刺激依存的なNF-κB 活性反応が増強されたが、一方カテプシンの酵素活性を失活させる変異体を導入した場合にはこの増強効果は認められなかった。また他のカテプシンファミリーについて検討したところ、カテプシンS/FもカテプシンB/Lと同様にTLR9活性の増強効果を示し、カテプシンHに関しては無効であった。また、カテプシンの酵素活性阻害剤を用いた実験によりマウス初代培養B細胞のTLRリガンド刺激依存的な活性反応を測定したところ、阻害剤によってCpG刺激により誘導される細胞活性反応が抑制された。興味深いことにカテプシンの阻害剤はCpG刺激依存的な活性反応のみならず、TLR3/7リガンド刺激に対する細胞活性反応をも抑制した。以上よりカテプシンの酵素活性は核酸認識TLRに影響を与えていることが明らかである。次いでカテプシンの作用機序についても検討したところ、TLR9がCpGを認識する場であるエンドリソソームにおいてpH依存的にカテプシンが基質を切断しTLR9活性反応に影響を与えている可能性が示唆された。//第二章では、カテプシンのTLR9応答における役割について解析を進めた。カテプシンが切断する基質として第一にTLR9が推測されうるが、これを示唆する結果が先日二つのグループから報告された。私自身もカテプシンがTLR9を切断し機能的フォームを生じるのではないかと推測し、TLR9の構造について検討を加えた。これまでの報告ではウエスタンブロットにおいて、TLR9分子の全長サイズのバンドだけが検出されていたが、本研究においてTLR9を各種細胞株に強制発現させてそのフォームを確認したところ、TLR9が切断されていることが明らかとなった。TLR9が切断修飾を受けるのは細胞内小器官のいずれかであると推測されるので、TLR9の細胞内移動を制御していると報告されているPRAT4A分子とUnc93-B分子に関連して解析した。その結果、この二分子それぞれによるTLR9の細胞内移動制御はTLR9の切断メカニズムに重大な影響を与えていることを証明し、TLR9のcleaved formが機能的である可能性が示唆された。また内在性TLR9を検出することにより生体内において生理学的にcleaved TLR9が存在していることが明らかになったため、TLR9が切断されるという現象についてさらに検討を加えた。TLR9 cleaved formのN末端配列分析結果をもとにTLR9の切断部位を決定し、non-cleaved コンストラクトを作成した。現在このコンストラクトを用いて解析を進めている。//以上の研究により、TLR9をはじめとする核酸認識TLRのリガンド認識においてカテプシンのプロテアーゼ活性が関与していることを発見した。またTLR9のcleaved formが機能的である可能性を見出した。現在、核酸認識TLRと自己免疫疾患などの病態との関わりが明らかになる一方で、リガンド認識における分子メカニズムについては大部分が未知である。それゆえに、本研究により明らかとなった分子レベルでの基礎情報は今後の研究に貢献し、ひいては疾患治療に発展する可能性を有している。
内容記述: 報告番号: 甲24795 ; 学位授与年月日: 2009-03-23 ; 学位の種別: 課程博士 ; 学位の種類: 博士(医学) ; 学位記番号: 博医第3215号 ; 研究科・専攻: 医学系研究科病因・病理学専攻
URI: http://hdl.handle.net/2261/55839
出現カテゴリ:021 博士論文
1120620 博士論文(病因・病理学専攻)

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