ネコフォーミーウイルスの分子生物学的研究

畠間, 真一

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Butyrate\u3067\u51e6\u7406\u3057\u305f\u5834\u5408\u306b\u306f\u3001\u3044\u305a\u308c\u306e\u30a6\u30a4\u30eb\u30b9\u682a\u306b\u3082\u76ee\u7acb\u3063\u305f\u30a6\u30a4\u30eb\u30b9\u7523\u751f\u306e\u4e0a\u6607\u306f\u898b\u3089\u308c\u306a\u304b\u3063\u305f\u3002\u307e\u305f\u3001\u30d2\u30c8\u30d5\u30a9\u30fc\u30df\u30fc\u30a6\u30a4\u30eb\u30b9(HFV)\u3092\u6301\u7d9a\u611f\u67d3\u3055\u305b\u305f\u30cf\u30e0\u30b9\u30bf\u30fc\u814e\u81d3\u7531\u6765\u7d30\u80de\u682a(BHK-21)\u306b\u5bfe\u3057\u3066\u306f\u3001\u3044\u305a\u308c\u306e\u85ac\u5264\u3082\u52b9\u679c\u3092\u8868\u3055\u306a\u304b\u3063\u305f\u3002\u3057\u305f\u304c\u3063\u3066\u3001Coleman\u682a\u306e\u518d\u6d3b\u6027\u5316\u306b\u306f\u3001TA\u7279\u7570\u7684\u306a\u30d2\u30b9\u30c8\u30f3\u306e\u30a2\u30bb\u30c1\u30eb\u5316\u304c\u5f71\u97ff\u3059\u308b\u3053\u3068\u304c\u78ba\u8a8d\u3055\u308c\u305f\u3002\u3055\u3089\u306b\u30d7\u30ed\u30e2\u30fc\u30bf\u30fc\u9818\u57df\u306e\u5869\u57fa\u914d\u5217\u3092\u8abf\u3079\u305f\u3068\u3053\u308d\u3001FFV 3\u682a\u306e\u5185\u90e8\u30d7\u30ed\u30e2\u30fc\u30bf\u30fc(IP)\u9818\u57df\u306b\u306f\u5927\u304d\u306a\u9055\u3044\u306f\u8a8d\u3081\u3089\u308c\u306a\u304b\u3063\u305f\u304c\u3001LTR\u306eU3\u9818\u57df\u5185\u306b\u3042\u308b\u30d7\u30ed\u30e2\u30fc\u30bf\u30fc\u9818\u57df(nt.615-641)\u3067\u306f\u3001Coleman\u682a\u3068\u6bd4\u8f03\u3057\u3066\u3001S7801\u682a\u3084Sammy-1\u682a\u306b17\u5869\u57fa\u5bfe\u306e\u6b20\u640d\u304c\u898b\u3064\u304b\u3063\u305f\u3002TA\u306b\u3088\u308bColeman\u682aLTR\u306e\u7279\u7570\u7684\u6d3b\u6027\u5316\u306f\u03b2?Gal\u30a2\u30c3\u30bb\u30a4\u3067\u3082\u78ba\u8a8d\u3055\u308c\u3001TA\u7279\u7570\u7684\u306aColeman\u682a\u306e\u30a6\u30a4\u30eb\u30b9\u7523\u751f\u5897\u5f37\u4f5c\u7528\u306b\u306f\u3001\u3053\u306e\u9818\u57df\u306e\u95a2\u4e0e\u304c\u793a\u5506\u3055\u308c\u305f\u3002\u4ee5\u4e0a\u306e\u7d50\u679c\u304b\u3089\u3001FFV\u6301\u7d9a\u611f\u67d3\u7d30\u80de\u304b\u3089\u30a6\u30a4\u30eb\u30b9\u306e\u518d\u6d3b\u6027\u5316\u306b\u306f\u3001\u5c11\u306a\u304f\u3068\u3082\u30d2\u30b9\u30c8\u30f3\u306e\u30a2\u30bb\u30c1\u30eb\u5316\u3068U3\u30d7\u30ed\u30e2\u30fc\u30bf\u30fc\u306e\u914d\u5217\u304c\u5f71\u97ff\u3057\u3066\u3044\u308b\u3053\u3068\u304c\u63a8\u5bdf\u3055\u308c\u305f\u3002\u7b2c\u4e8c\u90e8\u3000FFV\u6025\u6027\u611f\u67d3\u304a\u3088\u3073\u6301\u7d9a\u611f\u67d3\u306b\u304a\u3051\u308b\u907a\u4f1d\u5b50\u767a\u73fe\u306e\u6bd4\u8f03\u3000FFV\u6301\u7d9a\u611f\u67d3\u6a5f\u69cb\u306e\u66f4\u306a\u308b\u89e3\u660e\u3092\u76ee\u6307\u3057\u3066\u3001\u6025\u6027\u611f\u67d3\u3001\u6301\u7d9a\u611f\u67d3\u304a\u3088\u3073TA\u306b\u3088\u308b\u518d\u6d3b\u6027\u5316\u72b6\u614b\u3067\u306e\u5404\u907a\u4f1d\u5b50\u306e\u767a\u73fe\u30d1\u30bf\u30fc\u30f3\u3092\u6bd4\u8f03\u3057\u305f\u3002\u3053\u308c\u307e\u3067\u306e\u5831\u544a(Meiering et al., 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ネコフォーミーウイルスの分子生物学的研究

https://doi.org/10.15083/00004241

	名前 / ファイル	ライセンス	アクション
	K-117257.pdf (7.2 MB)

Item type

学位論文 / Thesis or Dissertation(1)

公開日

2013-01-16

タイトル

ネコフォーミーウイルスの分子生物学的研究

言語

eng

資源タイプ

資源

http://purl.org/coar/resource_type/c_46ec

タイプ

thesis

ID登録

10.15083/00004241

ID登録タイプ

JaLC

その他のタイトル

Molecular Biological Studies on Feline Foamy Virus

著者

畠間, 真一

著者別名

識別子

9702

識別子Scheme

WEKO

姓名

ハタマ, シンイチ

著者所属

東京大学大学院農学生命科学研究科獣医学専攻

Abstract

内容記述タイプ

Abstract

内容記述

フォーミーウイルス(FV)は、レトロウイルス科・スプーマウイルス属に分類され、これまでにネコの他、ウシ、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、ヒヒ、アフリカミドリザル、アザラシ、ハムスターなど多くの動物種に、その存在が報告されている。ネコフォーミーウイルス(FFV)は、1969年に喉咽頭癌のネコリンパ節初代培養細胞から初めて分離され、それ以来世界各国で分離報告がなされた。一般的な感染経路は、唾液や咬傷による個体間の水平感染と、胎盤を介した母子間での垂直感染である。ネコに対する病原性や他の病原因子との相互作用等は、これまでのところ報告されていない。FVに近縁のヒト内在性レトロウイルスの存在も報告されているが、ネコに存在するかは不明である。FFVは、ネコ腎臓由来株化細胞のCRFK細胞に感染すると、合胞体形成、細胞の泡状化(これが「フォーミー(泡)」の由来)など、細胞変性効果(CPE)を誘導するが、そのCPEから生き残る細胞も出現し、持続感染状態になる。このようにin vitroでは強力にCPEを誘導し、in vivoでは免疫系から終生排除されないにも関わらず病原性が見られないことは、FVの研究により、レトロウイルスの病原性発現機構を解明する上で、大きな手掛かりが得られると思われる。　近年、FV研究は分子レベルで急速に進みつつあり、レトロウイルス属に分類される他の科と多くの点で違うことが明らかになってきた。レトロウイルス科のウイルスは通常、感染性ウイルス粒子中にRNAのゲノムを持つが、FVはRNAゲノムではなく逆転写後のDNAゲノムをも持つ。またFVはレトロウイルス属の中で、ゲノムサイズが一番大きく、構造遺伝子の他にいくつかの調節遺伝子をもち、非分裂細胞にも感染するという特徴も持つ。一般に病原性が無く、非分裂細胞にも感染するという特徴は、FVが新しいレトロウイルスベクターの候補として、卓越した安全性と利便性を備えていることを示している。本研究では、FFVの持続感染機構の解明とFFVを骨格とした新しいレトロウイルスベクターシステムを構築することを目指して、転写機構の解析および感染性遺伝子クローンの作製を行った。第一部　脱アセチル化酵素阻害剤(トリコスタチンA)によるFFV持続感染細胞からのウイルスの再活性化　FFVは、生体内で持続感染しており、感染したネコからは終生ウイルスが分離できる。一方、in vitroにおいては、FFV持続感染細胞株が樹立可能である。この持続感染機構を調べるために、FFV持続感染細胞株において、FFVの複製に影響を及ぼす因子について、3株(Coleman, S7801, Sammy-1)のFFVを用いて検討を行った。まずこれら3株をCRFK細胞に感染させ、生残細胞からそれぞれの株の持続感染細胞株を樹立した。これらを、ヒストンの脱アセチル化酵素特異的阻害剤であるトリコスタチンA (TA)とSodium Butyrate、脱メチル化剤である5-Azacytidineでそれぞれ薬剤処理したところ、TA処理によって3種類のFFV株の持続感染細胞のうち、Coleman株持続感染細胞においてCPEの誘導と、培養上清中へのウイルス産生量の濃度依存的増大が示された。一方、5-AzacytidineやSodium Butyrateで処理した場合には、いずれのウイルス株にも目立ったウイルス産生の上昇は見られなかった。また、ヒトフォーミーウイルス(HFV)を持続感染させたハムスター腎臓由来細胞株(BHK-21)に対しては、いずれの薬剤も効果を表さなかった。したがって、Coleman株の再活性化には、TA特異的なヒストンのアセチル化が影響することが確認された。さらにプロモーター領域の塩基配列を調べたところ、FFV 3株の内部プロモーター(IP)領域には大きな違いは認められなかったが、LTRのU3領域内にあるプロモーター領域(nt.615-641)では、Coleman株と比較して、S7801株やSammy-1株に17塩基対の欠損が見つかった。TAによるColeman株LTRの特異的活性化はβ?Galアッセイでも確認され、TA特異的なColeman株のウイルス産生増強作用には、この領域の関与が示唆された。以上の結果から、FFV持続感染細胞からウイルスの再活性化には、少なくともヒストンのアセチル化とU3プロモーターの配列が影響していることが推察された。第二部　FFV急性感染および持続感染における遺伝子発現の比較　FFV持続感染機構の更なる解明を目指して、急性感染、持続感染およびTAによる再活性化状態での各遺伝子の発現パターンを比較した。これまでの報告(Meiering et al., 2001)では、急性感染でLTRプロモーターおよびIPの両ウイルスプロモーターが活性化されているのに対し、持続感染では高いIP活性を保持したままLTRプロモーター活性だけが下がると考えられていた。これは、異なる細胞株を用いてプロモーター活性を比較した結果であるため、同じ細胞株(CRFK)で急性感染細胞と持続感染細胞を作製し、転写産物の発現パターンを調べたところ、以前の報告とは異なる結果が得られた。LTRプロモーターに由来する10.5、8.9、7.6および5.6kbのmRNAは、いずれの感染細胞でも強く発現していたが、IPに由来する2.6、2.2および2.0kbのmRNAは、持続感染細胞での発現が抑えられていることが分かった。これは、持続感染ではIP活性が抑制されていることを意味している。また、TAによる持続感染細胞からのウイルス発現の増強は、IPの活性化を特徴とした急性感染状態への移行ではなく、持続感染のRNA発現パターンを維持したままゲノムに挿入されたLTRプロモーターを直接活性化することによると考えられた。持続感染細胞では、IPに由来する遺伝子翻訳産物の発現も減少しており、このことからもIP活性の抑制が確認された。さらに、pol、env mRNAの発現パターンにも、急性感染と持続感染で違いが見られたことから、FFVの急性感染と持続感染では複製システムに違いがある可能性が示唆された。これらFFVの転写および翻訳パターンの違いは、in vivoにおけるFFVの急性感染と、それに続く持続感染の複製システムの違いを表していると考えられる。第三部　FFV感染性クローン及びHFVとのEnv組換えウイルスの作製と塩基配列の決定　FFV複製システムの解明と、ウイルスベクターへの応用を目指して、感染性FFV遺伝子クローンの作製と塩基配列の決定を行った。FFV Coleman株持続感染CRFK細胞から抽出したDNAをもとに、FFV特異的プライマーペアを用いたLA-PCRを行い、5' LTR-gag-pol、env-bel-3' LTRおよび全長をコードする3種類の遺伝子をクローニングした(pSKY1.0、pSKY2.0およびpSKY3.0)。またFFV S7801株全長をコードするプラスミドも同様に作製し(pSKY5.0)、全塩基配列を決定した。pSKY3.0およびpSKY5.0は、11,694および11,660塩基をコードし、予想される各遺伝子産物をFFV FUV株と比較したところ、約82?97および83?97%と高い相同性を示し、HFV-N株とは約18?60および34?60%であった。各プラスミドはCRFK細胞に導入後、TA処理を行うことで感染性ウイルスクローンを効率良く回収でき、pSKY1.0とpSKY2.0を同時に導入した場合、導入後4日目に103TCID50/mlのウイルスクローンが回収された。一方、全長をコードするpSKY3.0またはpSKY5.0を用いた場合には、導入後3日目に、>106、>103TCID50/mlの高力価のウイルスをそれぞれ回収することが出来た。さらに、pSKY3.0のenvおよびbel-1の5'側一部を含む領域をHFVの相同遺伝子と組換えたプラスミド(pSKY4.0)を作製し、BHK-21細胞でのウイルス発現を調べたところ、105TCID50/mlのウイルスを回収できた。ウイルス発現は、培養細胞におけるCPEの他、PCR、ウエスタンブロッティングによっても確認した。SKY3.0およびSKY4.0は、それぞれCRFK、BHK-21細胞でのみ明瞭なCPEを形成するが、in vitroでの感染性は広い宿主域にわたることが示された。またSPFネコに接種後30日で、血清中にGagに対する抗体価と、末梢血リンパ球からgag、env、bel-1に対する特異的遺伝子が検出された。したがってこれらは、in vivoにおいても複製可能であることが示唆された。　本研究によって、ヒストンのアセチル化は、FFV Coleman株持続感染細胞からのウイルス発現を増加させることが示された。また、FFVの急性感染システムおよび持続感染システムの違いは、FFVゲノムに存在する2種類のプロモーター(LTRとIP)の活性化パターンに大きく表れていたが、TAをFFV持続感染細胞に作用させた場合に、急性感染の複製システムへ復帰しないことが示された。一方、TAを用いることでFFV DNAクローンから効果的に感染性ウイルス粒子を回収することが可能となり、今後FFV転写システムの解明を行う上で有用なツールになると思われる。近年、FVによる遺伝子導入用ベクターの高い潜在能力が報告されており、本研究がレトロウイルスベクターの安全性と利便性の向上にも大きく貢献できるものと考えている。

書誌情報

発行日 2002-03-29

日本十進分類法

主題

465.8

主題Scheme

NDC

学位名

博士(獣医学)

学位

値

doctoral

学位分野

Veterinary Medical Science (獣医学)

学位授与機関

学位授与機関名

University of Tokyo (東京大学)

研究科・専攻

Department of Veterinary Medical Sciences, Graduate School of Agricultural and Life Sciences (農学生命科学研究科獣医学専攻)

学位授与年月日

2002-03-29

学位授与番号

甲17257

学位記番号

博農第2453号

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ネコフォーミーウイルスの分子生物学的研究

× 畠間, 真一

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