WEKO3
アイテム
新規な構造を有する糖質関連酵素のX線結晶構造解析
https://doi.org/10.15083/00004256
https://doi.org/10.15083/0000425604e1e57d-9cb9-4cfb-813f-314565ec012b
| Item type | 学位論文 / Thesis or Dissertation(1) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 公開日 | 2013-01-16 | |||||
| タイトル | ||||||
| タイトル | 新規な構造を有する糖質関連酵素のX線結晶構造解析 | |||||
| 言語 | ||||||
| 言語 | jpn | |||||
| 資源タイプ | ||||||
| 資源 | http://purl.org/coar/resource_type/c_46ec | |||||
| タイプ | thesis | |||||
| ID登録 | ||||||
| ID登録 | 10.15083/00004256 | |||||
| ID登録タイプ | JaLC | |||||
| 著者 |
日高, 將文
× 日高, 將文 |
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| 著者別名 | ||||||
| 識別子Scheme | WEKO | |||||
| 識別子 | 9732 | |||||
| 姓名 | ヒダカ, マサフミ | |||||
| 著者所属 | ||||||
| 著者所属 | 東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻 | |||||
| Abstract | ||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||
| 内容記述 | 糖質の代謝に関連する酵素(糖質関連酵素)は、触媒能を基に糖加水分解酵素(Glycoside Hydrolase, GH; EC3.2.1群)、糖転移酵素(GlycosylTransferase, GT; EC2.4群)、エステラーゼ、多糖リアーゼの4つのクラスに分類されている。各クラスは、アミノ酸配列に基づいて分類されたファミリーで構成されており、同一ファミリー内に分類される酵素は、立体構造、機能に高い類似性を示すと考えられる。GHは約12000の遺伝子が97のファミリーに、GTは約10000の遺伝子が75のファミリーに分類されている。近年、立体構造の決定や構造予測により、全く異なる機能を有するファミリー間で、立体構造の相同性が見出されてきた。そのため構造未知ファミリーの立体構造を解明することは、そのファミリー内の酵素のみならず、類似構造を有する多くのファミリーに対しても分子進化、触媒反応、基質認識機構などの新たな構造的知見を与えることが期待されている。本研究は、応用面で注目されている構造未知の糖質関連酵素ファミリーGH-42、GT-36を対象としてX線結晶構造解析を行った。これらの新規構造を構造既知ファミリーと比較し、糖質関連酵素の進化的、構造的関連について興味深い知見を得た。耐熱性β-ガラクトシダーゼ(GH-42) β-ガラクトシダーゼは、ラクトースをガラクトースとグルコースに加水分解する酵素である。E. coli由来のβ-ガラクトシダーゼは、ラクトースオペロンを形成するlacZ遺伝子の産物として知られ、α相補と呼ばれる特異な性質を応用した実験などに利用されており、有用酵素の一つとして知られている。近年、乳製品中ラクトースの加水分解活性を利用した乳業への応用が試みられ、工業利用を目指した耐熱性のβ-ガラクトシダーゼが注目されている。好熱性細菌Thermus thermophilus A4由来のβ-ガラクトシダーゼ(A4-β-Gal)は70℃で20時間以上安定な極めて高い耐熱性を有し、アミノ酸配列からGH-42に分類される。GH-42は、その有用性にもかかわらず反応機構、立体構造、触媒残基など不明であった。 本研究では1H NMRを用いて、A4-β-Galの反応が、加水分解反応の前後で糖アノマーの反転を伴わないアノマー保持型であることを明らかにした。またA4-β-Galの立体構造を、多波長異常分散法(MAD法)を用いて1.6Å分解能で決定した[1]。A4-β-Galの立体構造は、図1に示すようなTIMバレルフォールドを有していた。TIMバレルはGHの構造として最も多いフォールドであり、他のTIMバレル型糖質関連酵素との構造比較から触媒残基(Glu141、Glu312)を決定した。A4-β-GalのTIMバレルフォールドにはGHの進化上、以下の極めて興味深い点を見出された。GH及びGTは、基質と生成物のアノマーの関係から、アノマー反転型と保持型に分けられるが、それぞれ異なる反応機構をとることが知られており、これらの酵素は独立した分子進化を果たしたと考えられてきた。A4-β-Galは保持型酵素であるが、活性中心部位は保持型酵素、骨格となるTIMバレル構造は反転型酵素の構造を持つ、極めて特殊な形状であった。これは、A4-β-Galが反転型酵素と保持型酵素の進化の分岐を示しており、保持型・反転型酵素の構造的・進化的な関連を示す初めての発見であった。キトビオースホスホリラーゼ(GT-36→GH-94) GTは糖-リン酸エステル結合を含む供与体(多くは糖核酸)の高エネルギー結合を利用して受容体にグリコシル基を転移する反応を触媒する。加リン酸分解酵素(EC2.4.1.-)は、糖鎖にリン酸を付加しつつ切断し、糖リン酸を生成する反応を触媒するが、糖-リン酸の結合エネルギーは糖-核酸の結合エネルギーほど高くないため、反応は合成方向にも進む可逆性を有する。従って、加リン酸分解酵素は様々な糖鎖合成に応用できる可能性を持つ。加リン酸分解酵素は触媒能からはGTに分類されるべき酵素(GT-4、GT-35、GT-36)であるが、数種の加リン酸分解酵素はアミノ酸配列の相同性から、GHに分類されている(GH-13、GH-65)。そのため加リン酸分解酵素の分類は非常に複雑であり、また立体構造情報が少ないため、その反応機構やGH、GTとの関係は不明な部分が多かった。 Vibrio proteolyticus由来のキトビオースホスホリラーゼ(ChBP)はキトビオース(GlcNAc-β(1,4)-GlcNAc)+リン酸〓GlcNAc-α-1-リン酸+GlcNAcの反応を触媒する反転型の加リン酸分解酵素である。ChBPはセロビオースホスホリラーゼ(CBP; Glc-β(1,4)-Glc+リン酸〓Glc-α-1-リン酸+Glc)、重合度3以上のセロオリゴ糖に特異的なセロデキストリンホスホリラーゼ(CDP;(Glc)n+リン酸〓Glc-α-1-リン酸+(Glc)n-1)とともにGT-36に分類されていた。GT-36酵素の多くは、呼吸によりエネルギーを獲得することができない嫌気性生物が有しており、これらの生物では解糖系や脂質合成の初発物質である糖リン酸を、ATP依存的なグルコキナーゼの代わりに加リン酸分解酵素を用いて生成することで、エネルギーを節約していると考えられている。 本研究ではGT-36の酵素として初めてChBPの立体構造を、MAD法を用いて1.6Å分解能で明らかにした[2]。その立体構造は、既知のGTとは全く異なるフォールドを有する一方、GH-15、GH-65の酵素と相同性を示した(図2)。また、反転型加リン酸分解酵素として初めて基質(GlcNAc)、リン酸アナログ(硫酸)との三者複合体構造を明らかにした。これらの構造的基盤から、反転型加リン酸分解酵素の反応機構(図3)を明らかにした。この反応機構は、グリコシド結合を求核攻撃する分子がリン酸である点を除けば、反転型GHの反応機構と同じである。以上、ChBPとGHの立体構造、及び反応機構の相同性を踏まえて、GT-36は新たに設置されたGHファミリー(GH-94)に再分類されることになった。これは、GTに分類されていた酵素が立体構造の解明によりGHに再分類された最初の例となった。セロビオースホスホリラーゼ(GH-94) GH-94に分類されるCellvibrio gilvus由来CBP(CgCBP)は、反応機構、基質特異性、オリゴ糖合成への応用に関して、GH-94中最も詳細な解析が行われている酵素である。CgCBPについても結晶化に成功し[3]、ChBPの構造をサーチモデルとした分子置換法を用いて解析を行ったところ、活性中心部位にグルコース、グリセロール、リン酸が結合した立体構造を2.1Å分解能で決定した(図4)。この立体構造から、ChBPの構造解析では得られなかったリン酸の結合に関する知見が得られた。また、ChBPとの立体構造比較から、それぞれの基質特異性を決定している残基が明らかになった。 | |||||
| 書誌情報 | 発行日 2005-03-24 | |||||
| 日本十進分類法 | ||||||
| 主題Scheme | NDC | |||||
| 主題 | 464.5 | |||||
| 学位名 | ||||||
| 学位名 | 博士(農学) | |||||
| 学位 | ||||||
| 値 | doctoral | |||||
| 学位分野 | ||||||
| Agriculture (農学) | ||||||
| 学位授与機関 | ||||||
| 学位授与機関名 | University of Tokyo (東京大学) | |||||
| 研究科・専攻 | ||||||
| Department of Biotechnology, Graduate School of Agricultural and Life Sciences (農学生命科学研究科応用生命工学専攻) | ||||||
| 学位授与年月日 | ||||||
| 学位授与年月日 | 2005-03-24 | |||||
| 学位授与番号 | ||||||
| 学位授与番号 | 甲20161 | |||||
| 学位記番号 | ||||||
| 博農第2844号 | ||||||
